五分钟看懂crispr/cas技术，crispr cas9植物

侯静等原创文章，南京林业大学学报

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用专题报告侯静、毛金艳、翟辉、王杰、应同明* 与南京林业大学、森林遗传与生物技术部重点研究院联合创办南京林业大学林学院现代林业协同创新中心教育.

木本植物是生态环境的重要组成部分，在维持碳氧平衡、保护生物多样性、涵养水源等方面发挥着重要作用，而林木的推广利用对于建设也具有重大意义。我国的绿色经济。随着人们生活水平的提高，对林产品的需求逐渐增加，对其质量的要求也越来越高。森林优先树种、树质，优良遗传资源是林业发展的基础和前提。多年来，育种者利用杂交育种、诱变育种、多倍体育种等传统育种方法来选育优良品种。木本植物具有世代周期长、遗传负荷高、基因组倍性复杂等生物学特性，因此良种选育周期很长，盲目率较高，结果不理想，目标难以实现。的快速繁殖。 CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够对基因组进行精确定点编辑的技术，具有操作简便、制造成本低、周期短、效率高等优点。基因敲除、插入或替换以及染色体重组还可以对目标基因进行转录和表观遗传调控，从而精确引入目标性状。迄今为止，CRISPR/Cas技术已成功应用于多种动物、植物和其他生物，包括24科45属，并显着提高了植物产量、品质以及对生物和非生物胁迫的耐受性。培育一批性状优良的新品种，实现独特遗传资源的创新。本期论文推荐作者总结了CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用进展，回顾了现有问题和未来发展趋势。

下面就和学宝君一起来了解一下吧！

关于作者

通讯作者

尹同明先生（男，1970年2月出生），本刊副主编，南京林业大学教授，主要从事杨树遗传改良研究。

第一作者

侯静（女，1986年11月出生），南京林业大学讲师，主要从事林业和花卉育种工作。

关键词：CRISPR/Cas，基因组编辑，分子育种，木本植物，育种基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31901331）。引用格式：侯静， 毛金艳， 翟辉， 等. CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2021, 45(6):24-30.侯军， 毛建勇， 翟华， 等. CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2021, 45(6):24-30.DO110.12302/j.issn.1000-2006.202010017。

1 总结

木本植物育种周期长、遗传资源稀缺是限制木本植物遗传资源创新的主要因素。 CRISPR/Cas系统是新近发展起来的实现基因组定点精准编辑的技术，具有操作简便、周期短、效率高的优点，可实现基因敲除、插入、替换等。准确介绍目标特征。目前，该技术已应用于多种牲畜、昆虫和农作物，成功改良了多项性状，实现了繁殖资源的独特创新，显着缩短了繁殖年限。 CRISPR/Cas技术的出现为木本植物的遗传改良提供了机会。作者正在进行CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vis vinifera)、木薯等木本植物育种中的应用研究（综上所述，该技术可以固定T0代木本植物的优良基因型，显着改善生长、木性、抗病、耐旱等性状，加速木本植物的育种进程，实现育种效率的提高。但是，该技术在木本植物中的应用还处于早期阶段，还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等挑战，基于此，我们展望了该技术的应用前景CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用，为木本植物基因功能研究和育种提供有益参考。

2 文字

1 生长性状的改善

由于植物生长速度直接影响产量水平，研究人员正在尝试各种方法来提高植物生长速度。生物固氮对于提高产量、减少化肥使用、减少污染具有重要作用。豆科植物是生物固氮的经典模型，如何将这一机制引入非豆科植物，建立新型的非豆科植物固氮系统是国际生物学的课题，也是本项目的重要研究课题。持续研究发现，除了豆科植物外，还有一种非豆科植物Parasponia andersonii也能进行生物固氮。阿不思黄麻是一种快速生长的热带坎纳科树种，可用作研究与非豆科植物共生固氮的模型系统。比较基因组分析表明，豆科Yamajute 中有4 个与根瘤菌共生相关的同源基因（PanHK4、PanEIN2、PanNSP1 和PanNSP2）。为了进一步研究山黄麻中4个基因的功能，Zeijl等利用CRISPR/Cas9敲除山黄麻中的PanHK4、PanEIN2、PanNSP1和PanNSP2，双等位基因突变率在34.5%至66.7%之间。根据突变体的表型表达，发现Panhk4与促肿瘤活性相关，PanEIN2调节性分化，PanNSP1和PanNSP2是根瘤形成的重要基因，为共生氮研究的进展铺平了道路，我们大力推动。我们为阐明豆科植物的固氮系统和开发非豆科植物的共生固氮系统提供了基础。

植物的光合作用是有机物合成的主要途径，主要由光反应和暗反应两个步骤组成，包括光捕获、电子转移、光合磷酸化和碳同化等重要反应步骤。类胡萝卜素在光捕获步骤中发挥着重要作用，而八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是类胡萝卜素合成途径中的主要限速酶，可以催化八氢番茄红素从无色状态转变为有色状态。为了进一步验证PDS基因在光合作用中的功能，Fan等人于2015年利用CRISPR/Cas9技术敲除杨树中的PtoPDS基因。突变效率达到51.7%。突变植株具有明显的白化表型。我们成功证明了PDS基因在类胡萝卜素合成途径中的重要作用。随后，研究人员利用CRISPR/Cas9 敲除技术，在苹果(Malus spp.)、木薯(Cassava spp.) 和葡萄(Vitis uinifera) 等物种中创建了具有白化表型的PDS 基因突变体。目前，PDS基因是检测植物遗传转化系统和CRISPR/Cas9系统突变效率的指示基因。

植物激素影响细胞分裂、伸长和分化，在调节植物生长发育中发挥重要作用。独脚金内酯是最近发现的植物激素，欧美杂交葡萄（Vitis vinifera cv. Chasselas VvCCD8）胚胎细胞中的两个独脚金内酯基因VcCCD7和VcCCD7被敲除，突变植株产生的分枝数已显着增加。野生型。除独角金内酯外，植物还具有自上而下的生长素浓度梯度和自下而上的细胞分裂素浓度梯度，两者共同作用以维持植物的正常生长和分枝。这两种激素之间存在着复杂的调控网络，虽然在木本植物中的研究还很少，但预计通过利用CRISPR/Cas技术，将有可能分析生长素和细胞分裂素在木本植物生长中的调控机制。植物。将会完成。 2017年，Finlayson先生通过对拟南芥的研究，发现TCP型转录因子（BRANCHED1、BRANCHED2）可能通过抑制芽生长来影响植物形态，但BRANCHED2的作用较BRANCHED1低，发现较小。 2018年，Muhr等人以杨树（Populus spp.）为研究材料，利用CRISPR/Cas9技术分别敲除两个杨树同源基因BRANCHED1-1和BRANCHED2-1。它影响花蕾的生长，对叶片的发育也有一定的影响。此外，与拟南芥相比，BRANCHED2在杨树中比BRANCHED1发挥更大的作用，并且突变体的表型更明显。这一结果表明，虽然同源基因的功能在不同物种中可能相似，但它们可以进化成不同的性状，有必要对其所属物种进行研究。

2、材料性能的改善

木本植物的次生生长决定木材产量，具有重要的经济价值。次生生长是细胞分化和发育的复杂过程，包括次生细胞壁形成、木质化（木质素沉积）、程序性细胞死亡（PCD）和心材形成。这个过程涉及到多个转录因子家族、植物激素以及大量的植物激素。功能基因。由于林木生长周期较长，基因整合相对困难，因此对次生生长涉及的基因和转录因子的研究主要集中在拟南芥上，但由于拟南芥是一年生草本植物，很难没有次生生长或已经进行了转录因子研究。一些木材形成基因和相关的生物过程不能完全表征多年生木本植物的二次发育。 CRISPR/Cas9技术的出现为研究木本植物基因功能提供了平台。 NST/SND 是拟南芥木质部纤维细胞次生细胞壁形成的主要调节因子。 2019年，Takata等人以山杨为研究材料，敲除了4个与拟南芥直系同源的NST/SND，并验证了它们在木本植物中的功能。观察发现，敲除突变体中的木纤维、韧皮部纤维和木质部实质细胞的次生细胞壁较薄，有的细胞甚至没有形成次生细胞壁，这表明NST/SND的作用得到进一步证实。具有调节木纤维、木质部薄壁细胞和韧皮部纤维次生细胞壁形成的功能。毛白杨中的PtoMYB156是一种R2R3-MYB转录因子，当使用CRISPR/Cas9系统敲除PtoMYB156时，在毛白杨突变体植株的次生细胞壁形成过程中，杨树中的木质素、木聚糖和纤维素发生异位。研究结果表明，PtoMYB156对杨树次生细胞壁的形成具有负调控作用。 Plant 4-Coumaric Acid : 辅酶A 连接酶(4CL) 是类黄酮和木质素等苯丙素衍生物合成途径中的关键酶。杨树有两个4CL基因（4CL1和4CL2），表达模式分析显示4CL1主要在木质部表达，4CL2在幼叶表皮细胞表达。利用CRISPR/Cas9系统，我们敲除杨树717（Populus tremula alba clone 717-1B4）中的4CL1基因并验证其功能，并对4CL1敲除突变体的表型进行观察和统计分析，发现所有茎均发生突变。红棕色，木质素含量高，下降23%。由于木质素含量的降低改变了木质素单酚的含量并改变了植物茎的颜色，因此这种颜色变化可以作为木质素含量变化的性状指标。目前，一些参与木材形成的基因的功能正在利用CRISPR/Cas9技术进行验证，但是这个过程涉及大量的基因，并且已经测试了单个和多个基因，这使得我们能够准确地阐明木材形成的功能。每个基因及其相互关系。研究基因的突变表型需要投入大量的人力、物力和时间。利用高效便捷的CRISPR/Cas9基因编辑技术和高通量寡核苷酸芯片合成技术，大规模编辑与木材形成相关的基因和转录因子，建立大规模突变体库，可鉴定突变体。功能筛选是通过获得特定性状的突变体来确定控制特定性状的基因，并分析相应的基因功能，以确定所有基因如何协同工作，从而确定基因的序列，了解次生生长和发育过程是如何完成的。木材形成机制。

3 抗性性状的改善

3.1 提高抗病能力

植物病害是影响产量和品质的主要因素之一，目前主要采用化学方法防治，但化学杀菌剂不仅污染环境，而且降低细菌抗性、诱发性行为、破坏生态平衡。需要新的抗病植物品种。 CRISPR/Cas技术的出现为培育优良品种开辟了新途径。柑橘网状溃疡病是由柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri ssp.citri，Xcc）引起的一种高度破坏性的柑橘细菌性病害。 Xcc主要通过气孔和微小伤口侵入植物内部，引起果实、叶、茎的坏死性溃疡病斑，严重时引起叶片枯萎、落叶、落果。它对柑橘果实的品质和产量造成重大影响，给柑橘饲养业造成重大经济损失。研究结果表明，转录激活效应因子的一类PthA4和属于植物LBD（侧器官边界区域）家族的CsLOB1是易感基因，PthA4和CsLOB与植物的发生有关。柑橘类水果溃疡病。事实证明。 PthA4 靶向CsLOB 启动子的效应子结合位点，诱导CsLOB 基因表达，并可引起柑橘溃疡病症状。 2017年，Jia等利用CRISPR/Cas9对柚子（Citrus maxima）的CsLOB基因进行了编辑，获得了6个转基因品系，编辑效率为23.80%~89.36%。每种功能菌株对溃疡病都有不同的抵抗力。因此，在设计sgRNA时，为了通过移码突变造成基因功能丧失，提高突变效率，获得更高量的RNA，sgRNA应该放在基因编码区的下游ATG，最好是第一个或应该是尽可能靠近第二个外显子。便于后续筛查和鉴定。 CsLOB 启动子是PthA4 的结合位点。 Peng和同事随后使用CRISPR/Cas9技术敲除柑橘CsLOB1基因的启动子序列。突变体植株对柑橘溃疡病的抗性显着提高，部分突变品系对柑橘溃疡病的抗性也显着提高。它还可以完全抵抗Xcc入侵。序列分析发现，突变体植物的抗性强弱与CsLOB1基因启动子突变率有关，其中双等位或纯合突变体的抗性最强，仅为5.3%，且大部分突变体为嵌合体。总计百分比为73.7%。此外，在柑橘基因组中检测到205 个脱靶位点。因此，CRISPR/Cas9系统需要进一步完善，以减少嵌合体的产生和脱靶现象。 CRISPR-Cas12a是最新的基因组编辑技术，是CRISPR-Cas9的补充系统。利用CRISPR-Cas12a编辑葡萄柚CsLOB1基因的启动子序列，该突变菌株还表现出对柑橘溃疡病的高抗性。与CRISPR-Cas9 编辑相比，这两个系统造成的碱基丢失数量相似，但CRISPR-Cas12a 双等位基因变异的概率较低，仅为5%。尽管CRISPR-Cas12a 在研究葡萄柚抗病性方面具有一定前景，但提高编辑效率对于未来的应用至关重要。

疫霉属真菌是一类重要的植物病原体，寄主范围广泛，包括林木、蔬菜、花卉、草药等数以万计的植物。这种疾病极具破坏性和危害性。常见症状包括叶斑病、枝枯病、果实腐烂、根腐病、心腐病、茎溃疡病和其他营养器官腐烂。严重时可导致全株死亡，造成重大经济损失。因此，世界各国学者对疫霉的致病性及其引起的病害的防治进行了大量的研究。可可树是一种生产可可豆的热带树，是价值数十亿美元的巧克力产业的核心。如果疫霉感染一棵可可树，它会毁掉农场里的所有可可豆。为了提高可可树的抗病能力，研究人员广泛研究了可可的免疫反应机制，发现了几种可可病原体受体基因和下游途径的其他组成部分。其中，NPR3是一种水杨酸结合蛋白，可抑制病原体防御。 反应。当Fister等利用农杆菌介导的瞬时转化将CRISPR/Cas9系统引入可可叶组织并敲除TcNPR3时，敲除率达到了27%。对瞬时转化组织的序列分析表明，可可基因组中只有TcNPR3基因被编辑，并且不存在脱靶现象。 TcNPR3突变组织对疫霉感染的抵抗力增强，下游防御基因的表达也增加。这项研究表明，使用高效且特异的sgRNA不仅可以提高CRISPR/Cas9的基因组编辑效率，还可以降低脱靶风险，因此，sgRNA在成功的基因组编辑中发挥着重要作用，这是其中之一最重要的因素。

灰霉病是由灰霉病菌引起的一种重要病害，可危害果树、花卉、蔬菜等植物。长期以来，灰霉病主要通过多菌灵和磺酸盐等化学药剂进行防治，但细菌耐药性的迅速发展大大降低了其防治效率。随着CRISPR技术的发展，许多研究人员开始利用该技术培育新的抗病品种。 WRKY蛋白是植物特异性转录因子家族，共有74个成员。病原菌、损伤、植物激素等多种外界因素均可诱导WRKY基因的表达，该基因在生物和非生物胁迫引起的胁迫反应中发挥重要作用。 Wang等人设计了4个CRISPR/Cas9系统的sgRNA，敲除Thompson无核基因组中的VvWRKY52转录因子基因，获得了22株突变植株，其中15株为双等位基因突变，7株为杂合突变，具有总共72个T-DNA插入突变，没有出现脱靶现象。为了阐明VvWRKY52在生物胁迫中的作用，我们给突变型和野生型植物接种了灰霉病菌，表型观察显示所有T0代转基因植物都表现出对灰霉病的抗性，我是这么理解的。使用CRISPR时，需要考虑靶序列的CC，对不同突变株中靶序列的GC含量进行分析发现，GC含量在50%到70%之间通常需要更高的编辑效率。 /Cas9 基因组编辑系统内容对编辑效率的影响。

白粉病是一种真菌病害，有多种类型。该病主要为害植株叶片，严重时还可为害新梢、嫩梢、花芽、幼果，造成植株落花或上部芽死亡。新芽枯萎，花芽不能形成，树体衰弱，生长停滞，产量显着降低。葡萄白粉病是由勾线虫感染引起的一种严重病害，对葡萄生产业造成负面影响。分布于全国大部分地区，给果农造成巨大损失。科学家们正在进行葡萄白粉病的研究，并致力于白粉病的防治。葡萄抗病机制研究揭示了葡萄基因组中存在易感基因MLO-7，前期研究利用RNA干扰（RNAi）技术降低葡萄VvMLO7基因的表达，增强了葡萄的抗粉病能力。霉菌，增加了感染率，但降低了77%。由于RNAi技术高度脱靶的性质，创造新品种非常困难。为了培育出抗白粉病的商业葡萄品种，Malnoy和同事在2016年利用无DNA技术，将纯化的CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白和sgRNA直接引入霞多丽葡萄原生质体中，对MLO-7进行了突变。结果发现，当Cas9和sgRNA的含量比为3:1时，MLO-7基因的突变效率最高，并且没有发生额外的遗传修饰。这一过程不涉及任何外源DNA，在葡萄中建立了完全无DNA的基因编辑系统，可以获得与常规植物一样安全的基因编辑植物，这项技术将促进基因编辑的商业化应用。编辑植物，这是一项非常重要的技术，值得推广。植物。

木薯褐条病（CBSD）是由属于马铃薯Y病毒家族的两种RNA病毒引起的：木薯褐条病毒（CBSV）和乌干达木薯褐条病毒（CBSV）。该病使木薯叶脉出现羽毛状白化病，根部出现黄色或棕色软木状死斑，严重影响木薯产量。研究表明，病毒基因组接头蛋白（VPg）需要与木薯翻译起始因子4E（elF4E）亚型ncbp-1和ncbp-2相互作用才能引起棕条病毒毒力。美国研究人员利用CRISPR/Cas9技术，对木薯品种60444基因组中的ncbp-1和ncbp-2进行了编辑，产生了ncbp-1、ncbp-2、ncbp-1/ncbp-2突变体。突变体和野生型植株同时接种木薯褐条病病毒，表型观察发现，ncbp-1/ncbp-2双突变体植株木薯褐条病发病率显着降低，但发病症状明显减轻。显着减少。对所有获得的植物的分析表明，91%的突变体在目标位点有插入缺失，其中78%是纯合和双等位突变。 CRISPR/Cas9技术不仅实现了木薯基因组的双基因突变，而且实现了较高的编辑效率。

3.2 提高耐干燥性

干旱是由于植物根部到叶片的水分供应减少，导致叶片水势和膨压下降，严重影响植物的正常生理和代谢功能，抑制生长，甚至造成部分或全部死亡。植物的。统计数据显示，世界各地因缺水造成的农作物产量损失可能超过其他因素造成的产量损失总和，使其成为世界上最严重的灾害之一。日本国土面积的52.5%位于干旱、半干旱地区，但半干旱地区人工造林成活率和保存率只有30%，干旱地区也只有4%，是最高的。马苏。如果低于20%，将严重阻碍林业生产的发展和生态环境的改善。杨树广泛分布于北半球，是我国重要的工业用材林和生态防护林树种，具有生长快、早熟、产量高的特点，但对干旱环境较为敏感。杨树抗旱基因型的培育将进一步促进杨树生长，带动林木产业的发展。林木生长过程中，根负责吸收水分和养分，木质部导管负责将水分和养分输送到植物的不同部位。当植物面临干燥胁迫时，有两种机制可以帮助它们逃避和耐受干燥。这种逃逸机制通过促进根部生长来促进植物吸收水分。研究表明，拟南芥通过NF-YB2和NF-YC2与ABA响应元件的相互作用，提高了对环境胁迫的耐受性。为了了解NF-Y在杨树应激反应中的作用，我们利用CRISPR/Cas9系统获得了pdf-yb21突变体材料，通过表型观察，我们确定突变体的根部与野生型相比生长显着减弱，耐旱水平也显着降低，揭示了NF-Y转录因子在杨树耐旱性中的作用。当植物处于严重干旱条件下时，它们开始自我调节以避免组织细胞死亡。此时，木质部细胞快速感知并转导干燥信号，激活bZIP转录因子AREB/ABF，与组蛋白乙酰化酶（GCN5）和转录共激活因子（ADA2）相互作用，形成AREB。该复合物与ABA 响应基因的顺式作用元件ABRE 结合，介导组蛋白3 赖氨酸9 (H3K9ac) 的乙酰化和富集，诱导和促进ABA 依赖性基因的表达，并最终在植物中提高抗旱性压力。 2019年，Li等人以干旱条件下生长的毛果杨为研究材料，对木质部进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）绘制H3K9ac图谱，并分析转录组测序（RNA-seq）技术，基因的启动子含有76 个ABRE 元件，经过H3K9ac 修饰。他们利用RNA干扰技术抑制PtrAREB1-2和PtrGCN5-1的表达，并利用CRISPR/Cas9技术敲除PtrADA2b-3。三种基因突变植物的耐旱性均显着下降，并且H3K9ac、PtrAREB1-2、PtrADA2b-3和PtrGCN5-1的转录本都是杨树耐旱效应基因激活所必需的。我们表明，CRISPR/Cas9技术加速了杨树基因功能研究的进展，为林木耐旱分子育种技术奠定了理论基础。

4 挑战与前景

木本植物具有世代周期长、遗传负荷高、基因组倍性复杂等生物学特性，处理时间长，往往造成失明，难以获得理想效果。以达到快速繁殖的目的。操作简单、效率高的优点使CRISPR系统成为继锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应核酸酶(TALENs)技术之后的第三代定点编辑技术。利用CRISPR系统编辑木本植物基因组，实现物种独特创新，将大大加快木本植物育种进程。然而，大多数木本植物尚未建立稳定的遗传转化系统，这限制了CRISPR系统的广泛应用。目前，CRISPR/Cas9系统已经完成了目标基因的定点突变，导致只有杨树、黄麻、木薯、柑橘和葡萄等少数物种的基因功能丧失。具有改进的材料特性和抗性特征的突变株系。然而，CRISPR/Cas9系统的应用存在：个问题，例如：脱靶效应导致基因组非靶位点发生突变，降低植物表型性状的可靠性；编辑效率普遍较低。还有一些问题。低和不同目的基因的功能丧失效率明显不同；双等位突变体或纯合突变体很少，大多数突变体是嵌合体。这些问题不仅与CRISPR/Cas9系统有关，还与木本植物基因组的特殊性有关。大多数木本植物的基因组都经历了全基因组复制事件，导致基因组内存在大量重复序列。这些重复序列的存在使得sgRNA 能够靶向多个序列并导致脱靶突变。此外，虽然木本植物基因组杂合度较高，等位基因之间经常存在序列多态性，但目前这些已发表的基因组序列并不包含等位基因序列信息。等位基因，导致嵌合体的产生。因此，高质量的基因组信息是提高CRISPR编辑效率、减少脱靶效应、有效为高杂合基因组生成高质量单倍型基因组的关键因素，优选地，双等位突变体或T0代突变体的纯度为大大改善。拉紧。

目前，CRISPR主要演化为四大编辑系统：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13、CRISPR/Cas14。 CRISPR/Cas12 可识别富含T 的PAM 序列，是CRISPR/Cas9 的补充系统。该系统仅应用于葡萄柚，所得突变菌株表现出对柑橘溃疡病的抗性。未来的研究应根据目的基因的PAM序列选择相应的编辑系统，以提高木本植物的基因编辑效率。此外，sgRNA可以同时靶向多个基因或整个基因组序列，从而允许同时敲除多个基因并构建全基因组突变文库，该文库可用于研究冗余基因功能和基因调控。木本植物研究与遗传育种。木头